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효소반응속도론: KM, Vmax값 측정 실험2025.11.141. 효소의 기본 개념 및 작용 메커니즘 효소는 생물학적 반응의 촉매로서 기질과 결합하여 효소-기질 복합체를 형성하고 활성화 에너지를 낮춤으로써 물질대사 속도를 증가시키는 생체 촉매이다. 효소는 활성부위에서 기질과 상보적 결합을 하며, 전이 상태 안정화, 대체 반응 경로 제공, 기질의 바닥 상태 불안정화 등의 방법으로 반응 속도를 높인다. 효소의 활성은 온도, pH, 저해제, 활성제 등에 의해 영향을 받으며, 과도한 열에 노출되면 영구적으로 변성된다. 2. Michaelis-Menten 반응속도론 효소는 기질과 결합할 수 있는 활성...2025.11.14
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생화학 실험/실습 보고서 (아미노산의 적정)2025.01.231. 아미노산 적정 이 실험의 목적은 미지의 아미노산 용액을 염기성 용액으로 적정하여 적정 곡선을 통해 어떤 아미노산인지 확인하는 것입니다. 실험 방법은 0.2M NaOH 용액을 제조하고 pH 미터를 보정한 후, 0.1M 미지 아미노산 용액 A 10mL에 NaOH 용액을 0.5mL씩 떨어뜨리면서 pH를 측정하여 적정 그래프를 그리고 대략적인 pKa값과 당량점, 사용한 아미노산이 Lysine, Phenylalanine, Aspartic acid 중 하나인지 확인하는 것입니다. 1. 아미노산 적정 아미노산 적정은 아미노산의 농도를 정확...2025.01.23
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이화여대 생명과학실험 A+ 리포트(DNA plasmid transfection, Immunoprecipitation)2025.01.231. DNA plasmid transfection DNA plasmid transfection 실험의 목적은 고분자-유전자 복합체를 이용하여 동물 세포에 plasmid DNA를 넣어 세포의 형질을 전환하는 것이다. 이를 위해 먼저 단백질 A에 대한 염기서열 옆에 epitope tag인 V5 폴리펩타이드에 대한 염기서열을 같이 붙여서 플라스미드 DNA를 세포 내에 넣어준다. 그러면 플라스미드가 핵내에 들어가서 DNA 역할을 할 수 있고, 이후 벡터 DNA가 mRNA로 전사되어 V5가 붙은 단백질 A가 발현된다. 2. Immunopre...2025.01.23
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단백질 정량법 비교: BCA와 Bradford 분석2025.11.161. BCA Assay (Bicinchoninic Acid Assay) BCA assay는 562nm 파장에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하는 방법입니다. 보랏빛 착물 생성량이 증가할수록 흡광도 값이 커지며, 흡광도와 단백질 양이 비례합니다. Working Reagent는 MA, MB, MC를 25:24:1의 부피비로 혼합하여 제조하며, 60°C에서 1시간 반응시킵니다. 본 실험에서 미지시료의 평균 농도는 1.196 μg/ml로 측정되었습니다. 2. Bradford Assay Bradford assay는 Coomassie bri...2025.11.16
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Horseradish Peroxidase 효소 동역학 분석 실험2025.11.161. 효소 동역학 분석 (Enzyme Kinetic Assay) Horseradish Peroxidase (HRP)를 이용한 효소 동역학 실험으로, ABTS를 기질로 사용하여 분광광도계로 흡광도 변화를 측정했다. 다양한 기질 농도(50-400 μM)에서 시간에 따른 흡광도 변화를 405nm에서 20초 간격으로 5분간 측정하여 초기 반응속도(V₀)를 구했다. Michaelis-Menten 반응식과 Lineweaver-Burk plot을 이용하여 Vmax, Km, Kcat 값을 계산했다. 2. Lineweaver-Burk Plot 분석...2025.11.16
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SDS-PAGE를 이용한 단백질 크기 분석2025.11.161. SDS-PAGE 원리 SDS-PAGE는 단백질에 음이온 계면활성제인 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 처리하여 단백질을 1차 구조로 변성시키고 음전하를 띠게 한 후, 전기장을 가해 polyacrylamide gel 내에서 단백질을 이동시켜 크기를 측정하는 방법이다. SDS는 단백질의 비공유 상호작용을 끊고 단백질의 원래 전하보다 훨씬 강한 음전하를 부여하여 단백질의 질량에 비례하는 분리를 가능하게 한다. 2. 실험 결과 및 해석 본 실험에서 Protein A는 46kDa, Protein B는 56kDa로 측정...2025.11.16
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간조직 지질농도 측정 실험2025.11.161. 콜레스테롤 측정 500nm 파장에서 콜레스테롤의 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성했다. 1조와 2조의 표준곡선 공식은 각각 y = 1283.7x - 60.731 (R² = 0.9928)과 y = 954.46x - 36.968 (R² = 0.9919)이다. 원액과 10배 희석 용액의 콜레스테롤 농도를 표준곡선과 계산식으로 측정했으며, 원액의 경우 두 방법의 차이가 크지 않았으나 10배 희석 용액에서는 큰 차이가 나타났다. 이는 실험 과정에서의 오차로 인한 것으로 분석된다. 2. 중성지질 측정 중성지질 표준곡선은 1조 y = 14...2025.11.16
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Taq DNA polymerase의 발현 및 정제, 확인2025.11.171. Taq DNA polymerase 발현 및 정제 Thermus aquaticus에서 분리한 Taq DNA polymerase는 높은 온도에서도 변성되지 않는 특성이 있어 PCR에 널리 사용된다. E.coli를 숙주세포로 사용하여 pTTQ18 vector에 삽입된 Taq DNA polymerase 유전자를 발현시킨다. IPTG를 첨가하여 lac operon을 활성화시켜 단백질을 과발현시킨다. 세포 파괴는 lysozyme을 이용한 효소적 방법과 계면활성제를 이용한 방법을 사용하며, 고온 처리로 다른 단백질을 변성시킨다. Ammon...2025.11.17
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TA cloning, Mini prep, Enzyme cut 실험2025.11.171. TA Cloning TA cloning은 PCR 산물의 3'-A overhang과 T vector의 3'-T overhang 사이의 상보적 결합을 이용하는 클로닝 방식입니다. T4 DNA ligase를 사용하여 phosphodiester bond를 형성하고 ligation을 진행합니다. 본 실험에서는 insert DNA와 vector의 molar ratio를 1:3으로 설정하여 충분한 ligation이 일어나도록 했습니다. LacZ selection을 통해 transformation 성공 여부를 확인하며, white colon...2025.11.17
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단백질 정량분석 실험 예비레포트2025.11.171. 단백질 정량 분석법 단백질 정량 분석은 시료에 포함된 단백질의 양적 관계를 확인하기 위한 분석으로 많은 생화학 실험의 기본이 된다. 주요 분석법으로는 UV법, Lowry법, BCA법, Bradford법 등이 있다. UV법은 단백질을 구성하는 아미노산 중 방향족 고리를 지닌 티로신과 트립토판이 파장 280nm의 자외선을 잘 흡수한다는 점을 이용하며, Lambert-Beer's Law에 의해 흡광도와 단백질 농도는 비례 관계를 가진다. 2. 단백질의 구조와 기능 단백질은 약 20가지의 다른 아미노산들이 펩타이드 결합에 의해 길게 ...2025.11.17
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